Fisso il pensiero alla tremenda responsabilità del suo ufficio di Pastore supremo, aveva implorato lume dall'alto e ordinato pubbliche preghiere coll'indire un giubileo straordinario per tutto il mondo (Tav. XLVI): introdusse così nella Chiesa la pia pratica di aprire il giubileo al principio di ogni pontificato. 

Volendo risvegliare col proprio esempio la devozione nel popolo, rinnovò l'antico costume di celebrare nelle sette basiliche di Roma le solenni funzioni pontificie, dette Cappelle, che prima di lui facevansi in Vaticano. Superfluo il dire della magnificenza e pompa di quelle Cappelle, così celebri e così frequenti sotto Sisto V, alle quali egli non mancò mai d'intervenire, per quanto il tempo fosse cattivo. 

Ebbe una speciale devozione alla SS. Eucaristia, primo fra i Papi, che usasse portare a piedi e a capo scoperto il SS. Sacramento nelle processioni solenni: nel proprio sepolcro volle essere rappresentato in ginocchio in atto di adorare il SS., conservato in quella cappella (Tav. LV).

Della devozione alla Vergine e ai Santi, parlano le sue Bolle e i suoi monumenti: Egli approvò le Litanie della B. Vergine, chiamandole lauretane. Mise nel Canone dei Santi il laico francescano S. Diego (Tav. LXXIX) della Diocesi di Siviglia, morto in Alcalà nel 1463, e annoverò fra i Dottori il Serafico S. Bonaventura (Tav. LXXX), di Bagnorea, il quale, al dire dell'Alighieri (Par. XI-37), 

Per sapienza in terra fue
Di cherubica luce uno splendore.

Elevò a rito doppio o istituì le feste: della Presentazione della B. Vergine, di S. Gennaro Vescovo e M., di S. Placido, protomartire dei Benedettini, di S. Francesco di Paola, di San Nicola da Tolentino, di S. Antonio di Padova, e di S. Pietro Martire. 

S'occupò molto degli ordini monastici. Approvò l'Ordine dei Foglianti (frati cisterciensi), degli Agostiniani di S. Ambrogio ad Nemus, dei Minori Conventuali Riformati, dei Camillini e dei Chierici Regolari Minori: rese autonomi i benedettini di Monte Vergine, riformò l'Ordine della Mercede, e quello dei Cavalieri di Malta. Era sul punto di riformare notevolmente anche la Compagnia di Gesù, e mutarne persino il nome, quando fu sopraggiunto da morte. 

Eresse le diocesi di: Venden in Livonia, Funai nel Giappone (la prima di quel lontano regno), Loreto, Montalto, S. Severino e Tolentìno: dichiarò Fermo sede Arcivescovile: Teruel nella Spagna venne confermata Diocesi con aumento di rendite e nuovi statuti (Tavole LXXXI - LXXXII).

Creò 33 Cardinali, i quali emersero tutti per ingegno, per bontà di costumi e nobiltà di carattere: era assai severo nella scelta, e quando faceva una promozione amava far valere i titoli e le qualità dei nuovi eletti (Tav. LXXXIII)). 

Prima di lui il numero dei Cardinali variava secondo i tempi e la volontà dei Papi. Sisto V - ad esempio dei 70 seniori da Dio assegnati per consiglieri a Mosè - fissò a 70 il loro numero, dividendoli in tre ordini: 6 Vescovi, 50 Preti, 14 Diaconi (Postquam verus ille, 3 dic. 1586). E i papi, suoi successori, mai hanno sorpassato questo numero. 

Eresse in Titoli Cardinalizi le attuali Chiese: Trinità al Monte Pincio, S. Maria del Popolo, S. Maria della Pace, S. Maria in Traspontina, S. Pietro in Montorio, S. Agostino, S. Alessio. 

Per confermare maggiormente l' unione fra il Papa e i Vescovi, e impedire scissioni e nuove eresie nella Chiesa, volle ( Romanus Pontifex, 20 dicembre 1585) che si ritornasse all'antichissimo costume della Visita ad Limina, comandò cioè che tutti i Vescovi e Pastori di anime si presentassero a Roma in determinati periodi, a prestare ubbidienza al Romano Pontefice, dargli conto di sé e della propria diocesi e averne così lume, incoraggiamento ed aiuto. Dividendo la cristianità in zone, prescrisse che i Vescovi d'Italia e adiacenze ne avessero obbligo ogni tre anni, quelli dell'Europa occidentale ogni quattro: quei della rimanente Europa e dell'Africa Mediterranea ogni cinque: i Vescovi dalle altre parti del mondo ogni dieci anni. La Chiesa mantenne questo profondo concetto sistino, e l'odierno Codice di Diritto Canonico (can. 340-341) ne ha ricopiato sostanzialmente la divisione geografica. 

Altre sue Bolle celebri sono: Coeli et terrae Creator (5 Gennaio 1586) che condanna l'astrologia giudiziaria e l'arte della divinazione: Detestabilis (21 ottobre 1586) che regola la materia dei contratti: Cum frequenter (22 Giugno 1587) che dichiara nullo il matrimonio degli eunuchi: Cum de omnibus (26 novembre 1587) che esclude dagli Ordini religiosi gl'illegittimi e bastardi. 

La meravigliosa dottrina ed attività di Sisto V, risplende maggiormente nella edizione della Bibbia, allacui revisione prescritta dal Concilio di Trento, niuno fino a quel tempo aveva atteso di proposito. 

Sisto V affidò tal lavoro ad alcuni Cardinali; ma poco soddisfatto dell'opera loro, vi pose mano egli stesso. Compiuto un foglio, lo passava al Padre Toledo e ad alcuni Padri Agostiniani, valentissimi in tali materie: questi lo rivedevano e quindi lo spedivano alla Tipografia. Senonchè il Papa, esaminando l'edizione che fu compiuta negli ultimi mesi di sua vita e di cui si erano tirati cinquanta esemplari (Tav. LXXXIV)), vi trovo non pochi errori di stampa, e si vide necessitato di proibirne la vendita. Stava per tornare sull'opera sua con una nuova ristampa, quando venne colto dalla morte. L'edizione venne fuori due anni dopo (1592), sotto il Papa Clemente VIII, col nome di Bibbia Sisto- Clementina: è l'edizione ufficiale della Volgata, tuttora in uso nella Chiesa Cattolica. 

Tuttociò basterebbe per rendere veramente insigne la figura di Sisto V come Pontefice. Ma ad un'altra opera immortale e legato il suo nome: e cioè alla nuova organizzazione della S. Sede ordinata da lui con la Bolla: Inmensa aeterni Dei, del 23 Gennaio 1587. 

Fino al secolo XVI, il Papa governava la Chiesa insieme con i Cardinali riuniti in concistoro. In queste assemblee, i Cardinali deliberavano sulle questioni proposte dal Papa; il quale, dopo'aver udito il loro parere, decideva in ultimo appello. I concistori si tenevano ordinariamente ogni settimana, e su di essi gravava il peso immenso del governo ecclesiastico. 

Ma con lo sviluppo della potenza della Chiesa, questo sistema non era più sufficiente. Già Paolo III al tempo della Riforma, aveva creato la prima congregazione di Cardinali: quella del S. Ufficio o dell' Inquisizione che s'occupava soprattutto delle questioni di dogma. Gregorio XIII aveva anch'egli istituite alcune congregazioni: ma non erano esse che un rimedio transitorio a bisogni permanenti. 

Sisto V risolse di dare alla Chiesa una nuova costituzione, stabilendo una divisione organica di lavoro tra i Cardinali fuori di concistoro. Questa riforma di Sisto V, ancora in vigore, è contenuta nella detta Bolla Immensa aeterni Dei, che è indubbiamente un prodotto della sua penna. 

Sul principio della Bolla il Pontefice parla dell'ammirabile armonia che Dio ha posto nella sua opera della creazione in cui le creature tutte si servono e si completano mutualmente. Come v'è nella Gerusalemme celeste una certa gerarchia tra gli spiriti dei beati, cosi deve esservene una tra i pastori che sulla terra vegliano con cura sulle proprie pecorelle. Vi sono intorno al Sommo Pontefice settanta Cardinali, i più illustri membri della Chiesa, incaricati d'assisterlo coi loro consigli, di portar con lui il peso immenso della cristianità. Ma la Bolla fa risaltare come il Papa solo ha la pienezza del potere e che i voti dei Cardinali hanno un carattere puramente consultivo. Poi la Bolla mostra che la necessità di facilitare il disbrigo degli affari, spiega la creazione delle Congregazioni dei Cardinali. 

Le Congregazioni stabilite sono quindici: 1a del Santo Uffizio, istituita da Paolo III e riorganizzata da Sisto V, munita dei pieni poteri per inquisire su tutte le cause relative alla fede, dall'eresia fino all' abuso dei sacramenti;

2^a della Segnatura delle grazie per esaminare le domande di grazie e di favori non dipendenti dai tribunali ordinari; 
3^a dell' Erezione delle chiese e provvedimenti concistoriali per le domande di stabilire chiese patriarcali, metropolitane, cattedrali e capitoli; 
4^a dell'Abbondanza dello Stato Ecclesiastico per l'approvvigionamento di Roma e delle provincie; 
5^a dei Riti e Cerimonie per la liturgia, canonizzazioni, ecc.; 
6^a dell'Armata navale per la direzione della marina pontificia creata da Sisto V;
7^a dell' Indice per compilare la lista dei libri proibiti; 
8^a del Concilio di Trento per interpretare gli atti di quel famoso Concilio in ciò che riguarda i costumi e la disciplina; 
9^a Congregazione per alleviare il popolo dello stato ecclesiastico; 
10^a Congregazione per dirigere l'Università detta la Sapienza, che Leone X aveva fondata e Sisto V riorganizzò; 
11^a Congregazione dei Regolari per giudicare le contese fra i diversi ordini monastici; 
12^a dei Vescovi per ricevere le domande dei patriarchi, primati, arcivescovi, vescovi e prelati non regolari, e giudicare le loro contestazioni;
13^a del mantenimento delle strade, dei ponti, degli acquedotti; 
14^a della Stamperia, per la sorveglianza della tipograna vaticana;
15^a della Consulta di Stato, per rivedere i processi criminali e civili, salvo sempre la decisione definitiva del Papa. 

Di tutte queste Congregazioni, quelle otto che hanno attinenza al governo della Chiesa, aumentate o modiflcate secondo i bisogni dei tempi, sussistono ancora e alcune ne ritengono anche il nome primitivo: le altre che riguardano l'amministrazione temporale dello Stato, corrispondono ai Ministeri moderni degli Approvvigionamenti, Sgravio del popolo, Marina, Grazia e Giustizia, Istruzione pubblica, Lavori pubblici, ecc. Stato e Chiesa adunque governano oggi col sistema introdotto da Sisto V, da ciò il valore immenso di quell'organamento che ha fatto la sua gran prova reggendo all'urto dei secoli. « A Sisto V - esclama il De Hübner - torna l'onore di aver organizzato il lavoro della Chiesa! ».