Sisto V era imbarazzatissimo. Sicuramente condannava Enrico di Navarra, eretico: ma qual partito prendere di fronte ad Enrico III, re legittimo, e il Duca di Guisa, ribelle, ma ardente e vero difensore della fede? Avvenne nei primi mesi del suo pontificato la pace di Nemours fra questi due personaggi, e il papa, visti uniti i cattolici e reputando sincero il loro accordo, lancia la sua scomunica contro il Navarra interdicendolo dal trono francese. Ma quella di Nemours non era stata vera pace, e Sisto dovette limitarsi ad osservare gli avvenimenti, raccomandando l'unione e mandando ai due partiti cattolici (realisti e santa lega) la, sua benedizione. 

Nella giornata delle barricate quei della lega entrarono a Parigi: il re fuggì, ed Enrico di Guisa divenne padrone della città: ma il re, sullo scorcio di quell'anno, chiamati il Duca e il Cardinale di Guisa al castello di Blois col pretesto di intavolare un accordo, ve li faceva trucidare in sua presenza (24 Dicembre 1588). L'emozione di Sisto V fu indicibile, e lo lasciò ben vedera al concistoro che tenne poco dopo. Purtuttavia non la ruppe col re se non quando questi, defezionando dalla causa della religione, fece causa comune col Navarra. 

Allora (12 Maggio 1589) mandò la bolla di scomunica al re: questi di lì a poco (1° Agosto) cadeva pugnalato da Giacomo Clement e riconosceva, morendo, per suo successore Enrico di Navarra, che ormai non aveva più a temere valenti competitori. Gli si oppose invece energicamente Sisto V, mandando in Francia (Settembre) il Legato Cardinale Gaetani con ingente somma di denaro (300 mila scudi) a favore della Lega, e proponendo a Filippo II (Dicembre) l'intervento in Francia di un poderoso esercito ispano pontificio. Il sovrano spagnuolo poteva in quel momento sperare la corona di Francia in compenso al disastro della sua Armada. Ma Enrico di Navarra vegliava: e coll'opera degli ambasciatori veneti, assai accetti a Sisto V, e del suo ambasciatore a Roma, il Duca di Lussemburgo, riuscì a disporre prima e a persuadere poi il Papa (Gennaio 1590) della possibilità e della sincerità della sua abiura. In Francia intanto si notava lo spettacolo di veder passare al campo di Enrico e avervi ormai la prevalenza, il fiore del clero e della nobiltà cattolica. Sisto comprese che la Francia non avrebbe perduta la sua fede unendo i suoi destini a quelli di Enrico di Navarra e cercò di svincolarsi dalla Spagna; e resistè, resistè finch'ebbe vita con coraggiosa fierezza alle pressioni della Lega e alle ire, alle proteste e alle minaccie dell'Olivares. Sisto vide con soddisfazione la vittoria di Enrico ad Ivry: ma non potè ricordare la sua abiura e il suo ingresso a Parigi, che aveva desiderato e preparato.